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本产品是一种用于细胞或组织β-半乳糖苷酶原位染色检测的试剂盒。β-半乳糖苷酶是一种常用的报告基因分子，通过原位染色，在普通的光学显微镜下就可以用于检测到β-半乳糖苷酶的表达。本试剂盒可以用于组织切片的染色，也可以用于培养细胞的染色。

本试剂盒以X-Gal为底物，在β-半乳糖苷酶的催化下会生成深蓝色产物。从而在光学显微镜下很容易观察到变成蓝色的表达β-半乳糖苷酶的细胞或组织。

本试剂盒经过多方面的优化，能兼容普通的细胞培养用多孔板、移液管等聚苯乙烯类材质耗材或容器的试剂盒。本试剂盒可以有效避免由于和多孔板、移液管等的不兼容导致的染色偏弱、染色效果不稳定等情况。通常同类试剂盒要求使用可高温高压灭菌的聚丙烯(polypropylene)材质的耗材、容器或玻璃容器进行溶液的配制，而不能使用普通的多孔板、移液管等聚苯乙烯(polystyrene)类材质的容器或耗材，否则可能会出现絮状沉淀，影响实验观察。即使严格按照要求操作，也会在染色时间比较长的情况下，容易出现絮状物沉淀(参考图2)。本试剂盒经过多方面的优化，对耗材或容器的材质无特殊要求，可以兼容普通的多孔板和移液管等常用耗材和容器。而且配制的工作液不会产生沉淀或不溶物，使用更加便捷。

图2.本试剂盒优化前后的对比图。优化前，X-Gal溶液直接接触聚苯乙烯类材质的材料如移液管、多孔板等会产生明显的腐蚀(A图)，使用聚苯乙烯容器配制染色工作液后，在显微镜下观察有异常的絮状不溶物(C图)；优化后，X-Gal溶液直接接触聚苯乙烯类材质的材料观察不到有任何异常情况(B图)，使用聚苯乙烯容器配制染色工作液后，在显微镜下观察也没有任何异常情况(D图)。

组分	规格
β-半乳糖苷酶染色固定液	100mL
X-Gal溶液	5mL
β-半乳糖苷酶染色液A	1mL
β-半乳糖苷酶染色液B	1mL
β-半乳糖苷酶染色液C	100mL

保存：-20℃，避光，有效期一年。


如果使用6孔板检测，足够测定100个样品；使用24孔板测定，足够测定400个样品；使用96孔板测定，足够测定1000个样品。对于组织切片或组织块，可以检测的样品数量视样品的大小而定。对于普通切片的滴染足够检测100个样品。

• β-半乳糖苷酶染色固定液对人体有毒、有腐蚀性，操作时请特别小心，并注意有效防护以避免直接接触人体或吸入体内。
  
• X-Gal溶液在-20℃或4℃保存会冻结，室温或37℃水浴2～5分钟并适当摇动即可完全融解。
  
• β-半乳糖苷酶染色液B在刚刚溶解后会观察到有沉淀，属正常现象，充分混匀或Vortex后，沉淀会全部溶解。作为常规，试剂使用前必须确保沉淀全部溶解，并且混匀。
  
• 使用96孔板等多孔板进行检测时，如果孵育过夜容易产生所谓的“边缘效应”(edge effect)，即多孔板四周的孔由于和外界最直接接触，易受外界环境影响，其中最明显的是四周细胞培养孔的蒸发效应。边缘效应会导致细胞生长不均匀、细胞分布不均一、培养液体积不一致、培养液中相关成分的浓度、pH值不一致。建议采取以下方法避免96孔板等多孔板的边缘效应：避免孵育过长时间，以避免蒸发等带来的边缘效应；弃用边缘孔并在弃用的边缘孔中加入等量的水、PBS或其他适当溶液；在多孔板非孔的凹陷处加入适量的水或其他适当溶液；将整块板放在湿盒中；使用防挥发盖；在实验设计时，实验样品最好进行随机分配，不要将某一组样品固定放在某个位置而引入可能的系统性误差。
  
• 需自备PBS。

• 对于培养细胞样品：
  
  • 转染细胞：采取适当的方法将表达β-半乳糖苷酶的质粒转染细胞。转染细胞24～48小时后可以使用本试剂盒进行原位染色，检测β-半乳糖苷酶的表达。
    
  • 对于6孔板，吸除细胞培养液，加入1mL β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定10分钟。对于其它类型的培养板，固定液及后续溶液的用量参照此比例进行操作。
    
  • 吸除细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。
    
  • 吸除PBS，每孔加入1mL染色工作液。染色工作液的配制如下：
    

    成分	用量
    β-半乳糖苷酶染色液A	10μL
    β-半乳糖苷酶染色液B	10μL
    β-半乳糖苷酶染色液C	930μL
    X-Gal溶液	50μL

  • 37℃孵育20分钟至2小时，或更长时间，直至部分细胞的颜色变蓝。如果孵育时间较长，可以用parafilm或保鲜膜封住6孔板防止蒸发。
    
  • 普通光学显微镜下观察。如不能及时观察计数，可以去除染色工作液，加入2mL PBS，4℃可以保存数天。如果用于计算转染效率，转染效率＝染色阳性细胞数/总细胞数×100%。
• 对于组织切片或非常小的组织块：
  
  • 对于组织切片或非常小的组织块，加入适当体积的β-半乳糖苷酶染色固定液，以充分盖住组织为宜，室温固定不少于10分钟。对于小的组织块，固定时间应该适当延长。
    
  • 用PBS洗涤组织3次，每次不少于5分钟。对于组织块，时间还要适当延长。
    
  • 吸除PBS，每孔加入1mL染色工作液。染色工作液的配制参照上面对于培养细胞样品的第4步。
    
  • 37℃孵育20分钟至2小时，或更长时间，直至部分细胞的颜色变蓝。如果孵育时间较长，可以用parafilm或保鲜膜封住放置组织的容器，以防止蒸发。
    
  • 吸除染色工作液，用PBS洗涤组织3次，每次不少于5分钟。对于组织块，时间还要相应延长。
    
  • 普通光学显微镜下观察。如不能及时观察，可以去除染色工作液，加入2mL PBS，4℃可以保存数天。

相关搜索：β-半乳糖苷酶原位染色试剂盒，In Situ β-galactosidase Staining Kit